克隆感受態(tài)細胞

一、克隆感受態(tài)細胞基因型

F- φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F) U169 endA1 recA1 hsdR17(rk-,mk+) supE44λ- thi -1 gyrA96 relA1 phoA

二、產(chǎn)品說(shuō)明

DH5α菌株是實(shí)驗室常用的感受態(tài)細胞。 缺失核酸內切酶 (endA)，提高了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量；重組酶缺陷型 (recA)減少插入片段的同源重組概率，保證了插入DNA 的穩定性；lacZΔM15的存在使DH5α可用于藍、白斑篩選。DH5α感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉化效率>5×108 cfu/μg DNA。

三、克隆感受態(tài)細胞操作方法

1. DH5α感受態(tài)細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手bo打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì )降低轉化效率。

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的無(wú)菌培養基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200 rpm復蘇60分鐘。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的2YT或LB培養基上。

5.將平板倒置放于37℃培養箱過(guò)夜培養。如果進(jìn)行藍白斑篩選操作，將平板放37℃培養至少15小時(shí)。

四、注意事項

1. 感受態(tài)細胞在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(cháng)，長(cháng)時(shí)間存放會(huì )降低轉化效率。
2. 混入質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物時(shí)應輕柔操作。
3. 轉化高濃度的質(zhì)?；蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應減少最終用于涂板的菌量。